描述

HepG2细胞来源于一名15岁的白人少年的肝癌组织.该细胞分泌多种血浆蛋白：清蛋白、α2-巨球蛋白、血纤维蛋白溶酶原、铁传递蛋白等。HepG2细胞广泛应用于遗传毒理学试验、外源性生物性异物的细胞毒性、乙型肝炎病毒感染机制、病毒培养等方面的研究。由于其与肝细胞具有相同的生物学活性，还被用于胰岛素抵抗的研究。

HepG2人肝癌细胞基本信息

培养条件

操作步骤

复苏：

1. 从液氮或-80℃冰箱中取出细胞，放入37℃水浴锅中，快速轻轻晃动，使冻存液迅速融化。解冻速度应快（大约2分钟）。为了减少污染的可能性，保持o形圈和封盖远离水。

建议:复苏前10 min从液氮罐取出，放于-80℃，让管中液氮挥发，防止炸管。

2. 一旦将细胞解冻，就立即将冻存管从水浴中取出，并通过浸入或喷洒70%的乙醇来去污。从现在起所有的操作应在严格的无菌条件下进行。

3. 将细胞悬液转移到含有9.0 mL完全生长培养基的离心管中。并以大约125 x g旋转5到10分钟。

4. 弃出上清液，加入适当的新鲜生长培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。并分配到适当数量的培养瓶中。在细胞的恢复过程中，避免培养基的过度碱度是很重要的。建议在添加小瓶内容物之前，将含有完全生长培养基的培养容器置入培养箱中至少15分钟，以使培养基达到其正常的pH值（7.0至7.6）。

5. 在合适的培养箱中培养至37℃。

建议:接种2h内不可移动、观察细胞。这会影响细胞贴壁，造成状态不佳、细胞聚团、贴壁不均匀等情况

传代：

 细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1次。

b. 加入不含EDTA的0.25%胰酶，放置在37°℃的培养箱中，2分钟，即可轻松吹打下来 

c. 放入1.5ml锥型离心管中，800转每分钟，离心3分钟，目的是除去细胞碎片等其他杂质，使细胞更加干净

d. 将离心管中上清液吸出，只留下沉淀，再加入新鲜的完全培养基，吹打均匀后加入到细胞瓶中或者平皿中

e. 将细胞悬液按1:3-1:6比例（首次传代建议1:2），分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养

冻存：

 待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面250px皿为例;

1. 收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，加 1 mL新鲜培养基重悬细胞，进行细胞计数。

2. 根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度2×10^6-1×10^7/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液

3. 在冻存管上做好标识，包括细胞名称、细胞代数、冻存日期、操作者姓名

4. 根据冻存液种类和冻存设备选择对应冻存步骤。记录冻存管位置以便下次拿取。

若选用通用细胞冻存液或自配冻存液，细胞分装完后将冻存管放入梯度降温盒直接放置于-80℃冰箱中。

若不是用程序降温盒，则按照下列顺序依次降温：室温→4℃20min→-20℃30min→-80℃过夜，注意转移过程中要保冷，避免产生温差或冻存管融化。

若选用非程序细胞冻存液，可用非程序性冻存液重悬细胞后，直接将冻存管分散放入-80℃冰箱中。过夜后即可将细胞转移入液氮长期保存。

常见问题及解决方法：

1、细胞生长慢

培养条件适宜的情况下，在T25培养瓶中生长的HepG2细胞，以1:2传代后，培养2-3天可以到达80%汇合率。若细胞生长过慢甚至不生长，可将血清增加至15%-20%（不要超过20%），待细胞恢复生长速度后再将血清比例降低到10%。细胞接种密度不可过低，否则生长非常缓慢。

2、细胞聚团或不贴壁

血清品质和培养基pH是影响HepG2细胞贴壁性的关键因素。部分操作者表明使用DMEM容易聚团通常HepG2细胞呈单层生长，但遇到不合适的血清，细胞可能呈现聚集倾向，最终聚团且不易消化开；也可能贴壁性变弱，漂浮细胞变多。使用高品质胎牛血清，可以帮助细胞更好地贴壁及形成单层细胞。

pH过高过低都将影响细胞贴壁性，每天观察培养器皿中培养基的颜色，偏黄及时换液，偏紫时检查培养箱CO2供应是否正常，培养瓶是否透气，并及时换液。

在离心收集细胞并去除上清，加2mL完全培养基重悬细胞，可用巴氏吸管吹打后，再用移液器稍加吹打，可有效减轻细胞聚团，尽可能分散成单个细胞；

3、漂浮细胞多

排除上文中提到的血清和pH对细胞贴壁的影响，传代或复苏后若有部分细胞漂浮，是正常现象，随着培养部分漂浮细胞会逐渐贴壁。漂浮细胞较多时不要扔，使用台盼蓝检查细胞活性，若大部分是活细胞，将这些细胞离心收集后重新接种至原瓶。增加血清量（总比例不超过20%）可以促进贴壁。消化时需注意时间不能太长，第一次消化该细胞要摸索最佳时间。中和时轻柔吹打，控制吹打次数和力度，可有效减少传代后漂浮细胞。

4、有圆形细胞粘附在贴壁的单层细胞上

这在HepG2培养时是常见现象，这些细胞可能是尚未完全贴壁或者正处于分裂期的细胞，无需对此特殊处理。

5、叠加生长

HeP-G2细胞生长特性是紧密连接成片状从四周延展增值,形成一座座的小岛状，细胞在增值过程中可能会看到轻微的白色小点形成，属于正常现象，细胞在胰酶消化时成片状细胞脱落，这时可稍微延长一点消化时间让大岛变小岛，再用巴氏吸管进行轻柔吹打光

6、空泡的形成

气泡的形成通常是压力的迹象。造成压力的一些原因包括血清质量不好、培养基中缺乏谷氨酰胺、添加了抗真菌试剂、培养基中碳酸氢钠浓度不合适、CO 2环境或培养基中的营养物耗尽等会出现这样的情况。培养条件的细微变化，特别是生长培养基中使用的 pH 和血清质量的变化，也可能影响细胞空泡的产生。

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