描述 

Caco-2细胞分离自一名72岁结肠腺癌白人男性患者直肠原位癌。当长到满时，Caco-2细胞表现出特征性的肠上皮细胞分化。Caco-2细胞表达热稳定肠毒素（Sta，大肠杆菌）、表皮生长因子（EGF）、维生素A酸结合蛋白I和视黄醇结合蛋白II，并呈角质蛋白阳性。Caco-2细胞可以用于3D细胞培养、高通量筛选、癌症研究和毒理学研究，也是一种合适的转染宿主。因此，Caco-2细胞模型广泛用于体外药物分子肠吸收、代谢和毒理学等领域的研究

Caco-2人结直肠腺癌细胞基本信息

培养条件

操作步骤

复苏：

1. 从液氮或-80℃冰箱中取出细胞，放入37℃水浴锅中，快速轻轻晃动，使冻存液迅速融化。解冻速度应快（大约2分钟）。为了减少污染的可能性，保持o形圈和封盖远离水。 

   建议:复苏前10 min从液氮罐取出，放于-80℃，让管中液氮挥发，防止炸管。

2. 一旦将细胞解冻，就立即将冻存管从水浴中取出，并通过浸入或喷洒70%的乙醇来去污。从现在起所有的操作应在严格的无菌条件下进行。 

3. 将细胞悬液转移到含有9.0 mL完全生长培养基的离心管中。并以大约125 x g旋转5到10分钟。 

4. 弃出上清液，加入适当的新鲜生长培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。并分配到适当数量的培养瓶中。在细胞的恢复过程中，避免培养基的过度碱度是很重要的。建议在添加小瓶内容物之前，将含有完全生长培养基的培养容器置入培养箱中至少15分钟，以使培养基达到其正常的pH值（7.0至7.6）。

5. 在合适的培养箱中培养至37℃。

传代：

细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1次。

b.加入0.25%胰酶消化液，放置在37°℃的培养箱中，2分钟，即可轻松吹打下来  

c.放入1.5ml锥型离心管中，800转每分钟，离心3分钟，目的是除去细胞碎片等其他杂质，使细胞更加干净

d.将离心管中上清液吸出，只留下沉淀，再加入新鲜的完全培养基，吹打均匀后加入到细胞瓶中或者平皿中

e.将细胞悬液按1:2-1:3比例，分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养

注意：为了避免结块，不要通过撞击或摇晃培养瓶来刺激细胞 在等待细胞分离的时候。难以分离的细胞可以放置在37℃以便于扩散。

冻存：

待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面10cm皿为例;

1.收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，加 1 mL新鲜培养基重悬细胞，进行细胞计数。

2.根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度2×10^6-1×10^7/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液

3.在冻存管上做好标识，包括细胞名称、细胞代数、冻存日期、操作者姓名

4.根据冻存液种类和冻存设备选择对应冻存步骤。记录冻存管位置以便下次拿取。

a).若选用通用细胞冻存液或自配冻存液，细胞分装完后将冻存管放入梯度降温盒直接放置于-80℃冰箱中。

b).若不是用程序降温盒，则按照下列顺序依次降温：室温→4℃20min→-20℃30min→-80℃过夜，注意转移过程中要保冷，避免产生温差或冻存管融化。

c).若选用非程序细胞冻存液，可用非程序性冻存液重悬细胞后，直接将冻存管分散放入-80℃冰箱中。过夜后即可将细胞转移入液氮长期保存。

细胞培养要点:

1. 细胞呈岛状生长,细胞群中常常含有巨大的空泡,这是CaCo-2细胞本身的特性,培养过程中会伴有细胞碎片或分泌物等呈现小黑点漂浮,属于正常现象。

2. CaCo-2细胞的传代周期较长,倍增时间约为72小时,这是因为CaCo-2贴壁和生长都较为缓慢。由于该细胞对营养需求高，建议使用高品质血清（Catalog#C0501）。如果细胞随着培养过程，漂浮得越来越严重，甚至大块儿飘起，就要检查培养基成分和培养环境是否出现异常。对于新复苏的细胞由于比较脆弱，一般第一次传代比例为1：2

3. CaCo-2贴壁缓慢,培养条件MEM(含NEAA)+20% FBS+1% P/S下,接种后需要48小时以上完成贴壁。为避免在细胞附着初期干扰细胞，建议到第三天再换液。期间不要频繁观察或晃动培养皿。

4. CaCo-2细胞较难消化,细胞间连接紧密,使得细胞难以解离。消化时间为5~10分钟,该细胞难以被吹散为单个细胞,当细胞能够被吹散为小的细胞团块,即可终止消化。

5. CaCo-2有少量发亮的细胞漂浮或黏附在细胞克隆上,是正常的,随后会进入克隆并正常生长。所以避免频繁观察细胞,可以减少漂浮细胞产生。细胞密度越高,消化时间越长。

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